雜質(zhì)蛋白鑒定與定量的完美結(jié)合-Hi3分析方法

　　液質(zhì)數(shù)據(jù)中，不但含有蛋白藥序列表達(dá)是否正確的肽圖信息，其它雜質(zhì)蛋白同樣可以被挖掘出來。然而，單純的雜質(zhì)蛋白鑒定卻又是不夠遠(yuǎn)遠(yuǎn)的，其確切的含量信息同樣至關(guān)重要。沃特世PLGS軟件可以在肽圖液質(zhì)數(shù)據(jù)中，進(jìn)一步鑒定其中的雜質(zhì)蛋白，并其相對含量信息進(jìn)行分析。

　　一、“順便”完成的雜質(zhì)蛋白鑒定與相對定量

　　使用相應(yīng)的開放數(shù)據(jù)庫，PLGS軟件首先根據(jù)液質(zhì)數(shù)據(jù)中的離子碎片信息對多肽進(jìn)行鑒定，進(jìn)而組裝出樣品中的所有蛋白，完成蛋白鑒定步驟。在蛋白相對含量測定中，PLGS軟件充分利用了MSE全信息串聯(lián)質(zhì)譜方法的數(shù)據(jù)優(yōu)點。較DDA方法，MSE數(shù)據(jù)的離子色譜峰近乎“完美”，更加符合實際多肽色譜峰型。通過全面研究發(fā)現(xiàn)，MSE數(shù)據(jù)中的多肽色譜峰強(qiáng)度信息，與蛋白濃度相關(guān)性非常好。使用每個蛋白鑒定多肽中，強(qiáng)度前三的多肽峰強(qiáng)度加和值，即表征其蛋白濃度。因此，使用PLGS分析同一個肽圖液質(zhì)數(shù)據(jù)，便可“順便”完成雜質(zhì)蛋白的鑒定與相對定量工作。

　　二、蛋白絕對含量測定

　　如果想得到樣品中準(zhǔn)確的蛋白絕對濃度信息，也非常簡單。只需在樣品中加入一個已知的蛋白內(nèi)標(biāo)便可。這時Hi3分析方法會根據(jù)內(nèi)標(biāo)蛋白的濃度，按照以下公式，對樣品中的絕對濃度進(jìn)行定量。

　　三、使用Hi3方法分析殘留宿主細(xì)胞蛋白(HCP)

　　融合抗體anti-phosphotyrosine IgG 1 (PTG1 mAb)使用中國倉鼠卵巢細(xì)胞系DG-44 CHO在兩種培養(yǎng)條件下表達(dá)，表達(dá)后的PTG1 mAb再分別使用A、B兩種方法純化。經(jīng)過2D-UPLC MSE方法采集液質(zhì)數(shù)據(jù)后，使用PLGS軟件分析[3]。在分析結(jié)果中，可以明確地給出鑒定到樣品中含有的雜質(zhì)蛋白，以及給出這些雜質(zhì)蛋白的相對含量結(jié)果(圖1)。為了驗證Hi3定量方法的可靠性，使用MRM方法對以上實驗結(jié)果中Clusterin、Elongation factor 1-alpha、Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase三個蛋白進(jìn)行了定量驗證。通過Hi3與MRM兩種定量方法結(jié)果對比，可以發(fā)現(xiàn)兩者定量濃度非常接近(圖2)。在使用PLGS進(jìn)行樣品中的雜質(zhì)蛋白鑒定與定量分析中，檢索方法設(shè)置與肽圖分析幾乎一致，只增加將參考蛋白的名稱與濃度列入分析參數(shù)一步。之后，所有的分析過程都將由PLGS自行完成，并直接給出蛋白鑒定身份與濃度的結(jié)果列表。實際上PLGS不僅使用在生物藥雜質(zhì)蛋白分析中，在樣品極為復(fù)雜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，Hi3方法已經(jīng)被長期使用。