胸腺肽的制備及檢定

　　(一) 原理胸腺肽是存在于人及多種動(dòng)物胸腺內(nèi)的一組具有免疫調(diào)節(jié)活性的熱穩(wěn)定性多肽。分子量多在8 000～13 000之間，等電點(diǎn)在35～95之間。胸腺肽的主要功能為誘導(dǎo)T細(xì)胞分化增殖，放大并增強(qiáng)成熟T細(xì)胞對(duì)抗原或其它刺激物的反應(yīng)及維持機(jī)體免疫平衡狀態(tài)。由于它的分子量多是小于10 000的多肽，故基本無免疫原性，所以由一種動(dòng)物胸腺中提取的小分子多肽，可用于其它各種動(dòng)物及人類，而不會(huì)引起超敏反應(yīng)。在實(shí)際工作中，

　　主要從牛、豬、羊等動(dòng)物的胸腺中提取胸腺肽。

　　(二) 材料和方法

　　1 材料主要包括高速組織搗碎機(jī)、低溫冰柜、電熱攪拌器、離心機(jī)、不銹鋼濾膜濾器、超濾器、紫外分光光度計(jì)及檢測(cè)E玫瑰花環(huán)試驗(yàn)所用儀器等。

　　2 方法

　　(1) 制備勻漿：將凍存的動(dòng)物胸腺取出融化，摘除脂肪及結(jié)締組織，洗凈，用絞肉機(jī)絞碎，將絞碎的胸腺內(nèi)加入適量注射用水(約為胸腺的25倍)，用高速組織搗碎機(jī)高速勻漿2次，每次1min，將勻漿置-20℃凍結(jié)。

　　(2) 去除雜蛋白：凍結(jié)勻漿緩緩融化后，置電熱攪拌器上加熱至約80℃，并不斷攪拌，共加熱攪拌15min。以3 000r/min離心20min，棄沉淀，取上清。

　　(3) 澄清及超濾：將上述上清液用1μm濾膜加壓過濾，過濾后的液體其濁度不大于5度。將該澄清液體通過超濾器，用分子量10 000膜超濾，透過液即為胸腺肽溶液。

　　(4) 后處理：用Folin酚法測(cè)多肽含量，根據(jù)含量，分裝安瓿并凍干，封口后待檢定。

　　(三) 檢定

　　1 pH值取本品用酸度計(jì)準(zhǔn)確測(cè)定酸堿度，其pH值應(yīng)為6～75。

　　2 熱原取3只符合要求的家兔，按規(guī)定進(jìn)行觀察后，每只通過耳靜脈注入75mg/kg胸腺肽藥液，觀察體溫升高情況，如不符合規(guī)定，應(yīng)取5只家兔復(fù)檢。判定標(biāo)準(zhǔn)為：在初試3只家兔中，體溫升高均在06℃以下，且3只家兔體溫升高總數(shù)在14℃以下時(shí);或在復(fù)試的5只家兔中，體溫升高06℃或06℃以上的家兔不超過1只，并且初試和復(fù)試合并8只家兔的體溫升高總數(shù)不超過35℃時(shí)，均認(rèn)為供試品熱原檢查合格。

　　3 超敏反應(yīng)取健康豚鼠6只，每只腹腔注射本品05ml，連續(xù)3次，于20天后即第4次自耳靜脈注入本品20ml，應(yīng)無超敏反應(yīng)現(xiàn)象發(fā)生。

　　4 急性毒性試驗(yàn)取小鼠，自尾靜脈注入本品045ml，同時(shí)腹腔注射2～3ml，48h內(nèi)不應(yīng)有死亡。

　　5 無菌檢查將本品分別接種到用以檢測(cè)需氧菌、厭氧菌及霉菌用培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)1周，應(yīng)無菌生長。

　　6 多肽含量測(cè)定用Folin酚法測(cè)定多肽含量，應(yīng)符合規(guī)定。

　　7 活力測(cè)定采用E玫瑰花環(huán)試驗(yàn)，對(duì)照管中加入淋巴細(xì)胞及綿羊紅細(xì)胞，試驗(yàn)管中加入淋巴細(xì)胞、綿羊紅細(xì)胞及適量本品。試驗(yàn)管的E玫瑰花環(huán)率應(yīng)較對(duì)照管高10%以上為合格。

　　(四) 注意事項(xiàng)

　　1 胸腺勻漿時(shí)應(yīng)細(xì)，眼觀應(yīng)呈細(xì)膩狀，否則可延長勻漿時(shí)間，增加勻漿次數(shù)。胸腺應(yīng)采自幼齡動(dòng)物，且新鮮無異味。

　　2 各步驟所用餾水應(yīng)均為無熱原注射用水。

　　3 過濾時(shí)，壓力不可過高，否則濾膜破裂，藥液則須重濾。