肉類中三聚氰胺的檢測方案

　　酶聯(lián)免疫吸附測定法定量測定三聚氰胺殘留。利用萃取液通過均質(zhì)及振蕩的方式提取樣品中的三聚氰胺進行免疫測定。先將三聚氰胺酶標(biāo)記物，樣品萃取物及標(biāo)準(zhǔn)加入到已經(jīng)包被有三聚氰胺抗體的微孔中開始反應(yīng)。在30分鐘的孵育過程中，樣品萃取物中的三聚氰胺與三聚氰胺酶標(biāo)記物競爭結(jié)合微孔中的三聚氰胺抗體，孵育30分鐘后洗掉小孔中所有沒有結(jié)合的三聚氰胺及三聚氰胺酶標(biāo)記物。再用去離子水清洗結(jié)束后，每孔中加入清澈的底物溶液，結(jié)合的酶標(biāo)記物將無色的底物轉(zhuǎn)化為藍色的物質(zhì)。孵育30分鐘后停止此反應(yīng)，根據(jù)各孔顏色深淺進行數(shù)據(jù)讀取。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的顏色得出樣品中三聚氰胺的的濃度值。

　　需要準(zhǔn)備的材料：

　　1、蒸餾水或去離子水

　　2、可吸取50ul和100ul的移液器及吸頭

　　3、4000轉(zhuǎn)離心機

　　4、吸水紙或相當(dāng)?shù)奈�水材�?

　　5、450nm的酶標(biāo)儀

　　6、計時器

　　7、20mM PBS：需自行配制

　　8、清洗液：需自行配制

　　試劑配制：

　　1、20mM PBS： 0.62g NaH2PO4·2H2O+5.73g Na2HPO4·12H2O+9g NaCl，蒸餾水定容至1000ml

　　2、清 洗 液： 0.62g NaH2PO4·2H2O+5.73g Na2HPO4·12H2O+9g NaCl，蒸餾水定容至1000ml.+0.5ml 土溫20

　　樣品的前處理： 肉類(稀釋倍數(shù)：5)

　　1、 稱1g肉樣，加入5ml的10%甲醇/20Mmpbs，震蕩2min;

　　2、 4000轉(zhuǎn)離心5min;

　　3、 取2ml 上清液加入2ml異辛烷：氯仿(2：3)，混勻;

　　4、 4000轉(zhuǎn)離心5min，取上層150ul測定。[/b]

　　測定過程：

　　1、將所有試劑及樣品回升至室溫20-28℃，但不要放置超過24小時;

　　2、從鋁箔袋中拿出要求數(shù)量的微孔條固定在微孔板架上，未使用的孔條與干燥劑一同放入密封袋中保存;

　　3、吸取150ul標(biāo)準(zhǔn)品、樣品到對應(yīng)微孔中，必須保證每種溶液使用干凈的吸頭吸取，避免交叉污染。加入

　　50ul三聚氰胺酶標(biāo)記物到每個小孔中;

　　4、輕輕搖板60秒，20-28攝氏度下孵育30分鐘;

　　5、將微孔中的溶液倒入水槽中，用清洗液完全充滿微孔，震蕩后倒掉，重復(fù)三次，總共四次洗板;

　　6、最后一次清洗完后，倒掉孔中溶液，然后翻轉(zhuǎn)微孔板在吸水紙上拍干;

　　7、每個微孔中加入100ul底物溶液;

　　8、20-28攝氏度下，孵育30分鐘;

　　9、每個微孔中加入100ul停止液;

　　10、450nm下讀板。