細(xì)胞爬片的制作方法

　　爬片的準(zhǔn)備

　　1. 爬片可用一般的蓋玻片，也可用專用爬片;

　　2. 應(yīng)用蓋玻片，可根據(jù)自己的需要剪裁成合適的大小，以備置于 6 孔板、12 孔板或 24 孔板;裁剪時可用前護(hù)士輸液用于打開玻璃安瓶的小沙輪，或者是口腔科的那種小沙輪，輕輕劃一下后，稍用力一掰就分開了。 如果接種大皿的話，我一般不將蓋玻片切開，直接清潔后放入培養(yǎng)皿中，到染色時再將之切 開，這樣既保證了細(xì)胞均一性，又可同時做幾個指標(biāo)的染色。

　　3. 將剪裁好的爬片，置于濃硫酸中浸泡并過夜，第二天先用自來水沖洗 20 遍，再置于無 水酒清中浸泡 6 小時，再用三蒸水沖洗 3 遍(個人認(rèn)為主要目的是將酸沖洗干凈就可以了，如果不干凈的話，細(xì)胞帖壁不好)，放在飯盒或者玻璃培養(yǎng)皿中烘干后進(jìn)行高壓消毒。

　　4. 高壓后取出放入烤箱中烤干，備用�？靖珊罂煞湃氤瑑襞_中。

　　5. 關(guān)于多聚賴氨酸，很多人都將玻片用此處理，以使細(xì)胞與玻片結(jié)合更牢。但我在做爬片時從來沒用過多聚賴氨酸，細(xì)胞貼壁仍然很好，且在做后續(xù)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色、TUNEL 等凋亡檢測、免疫熒光等也從未脫過片。

　　【細(xì)胞爬片】

　　1. 胰酶消化細(xì)胞后計(jì)數(shù)重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中。

　　2. 加細(xì)胞時，根據(jù)玻片的大小，先在每個孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴少量培養(yǎng)基，目的是使 玻片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起，然后放玻片，防止加細(xì)胞懸液時玻片漂起，造成雙層細(xì)胞貼片。整個過程注意無菌操作。

　　3. 根據(jù)自己的需要選擇合適的細(xì)胞密度種入培養(yǎng)板內(nèi)即可 4. 待細(xì)胞貼壁后，可去上清加含藥培養(yǎng)基。

　　5. 按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，作用一定時間后取玻片。取玻片時由于玻片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊，張力較大，我一般將注射器針頭針尖向背面弄個小鉤，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出 就可以了。如果要做諸如 24h，48h，72h等這樣時間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)的話，將所需數(shù)量的爬片取出時應(yīng)用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子。末取出的可接著繼續(xù)培養(yǎng)。

　　【細(xì)胞爬片的固定】 細(xì)胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。當(dāng)然，根據(jù)研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色時就避免洗，因?yàn)榈蛲龅募?xì)胞在洗的過程中有可能會 脫落。另外在保存細(xì)胞爬片的時候，我一般用培養(yǎng)皿或板，先在皿底放一層面巾紙，然后再放爬片，這樣方便做實(shí)驗(yàn)時取片。然后蓋上蓋子，并在蓋子上做標(biāo)記，為避免混淆，可用透明膠 帶將蓋子和皿連在一起。一般-20℃保存 2-3 個月的片子做免疫組化是沒有問題的。

　　以下為常用的固定液

　　1. 冷丙酮 可用于一般的免疫組化染色。將純的丙酮預(yù)先放入冰箱-20℃后便為冷丙酮(放心，丙酮在此溫度不會為固體的)細(xì)胞爬 片取出后，PBS洗 2 遍，便可加入冷丙酮于-20℃(丙酮有很強(qiáng)的揮發(fā)性，注意將含有丙酮 和爬片的器皿蓋嚴(yán)，防止其揮發(fā))固定 10 分鐘。取出后，室溫吹干，然后放入-20℃保存。

　　2. 多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫電鏡;也可用于免疫熒光以及TUNEL染色。 主要檢測組織內(nèi)一些性能嬌弱的抗原特別是細(xì)胞表面抗原，例如各類淋巴細(xì)胸分化決定簇 (CD)、主要組織相容性抗原等 室溫固定 15 分鐘后，將表面液體吹干，入-20℃保存。

　　3. 95%乙醇，可用于免疫組化。

　　優(yōu)點(diǎn)：穿透性強(qiáng)、抗原性保存較好。 缺點(diǎn)：但醇類對低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差，使蛋白變性的作用輕， 固定后可再溶解;染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應(yīng)強(qiáng)度 室溫固定 15 分鐘后，將表面液體吹干，入-20℃保存

　　4. 甲醛(福爾馬林)應(yīng)用最廣 優(yōu)點(diǎn)：形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，且穿透性強(qiáng)， 缺點(diǎn)： 甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色; 分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露�？稍斐杉訇幮缘娜旧�結(jié)果。 室溫固定 15 分鐘后，將表面液體吹干，入-20℃保存 。