細(xì)菌中提取分泌蛋白質(zhì)的方法

　　客戶需要從細(xì)菌中提取一種可分泌至培養(yǎng)基上清的一種小分子多肽，按照文獻(xiàn)的方法是取細(xì)菌上清后用氯仿抽提，可反復(fù)做過(guò)多次，蛋白總是沒(méi)有活性，不知道各位同仁有沒(méi)有什么好方法?請(qǐng)指教!

　　以下參考意見(jiàn)：

　　參考一：

　　氯仿是有機(jī)溶劑，所以但沒(méi)有活性。分離這種分泌性蛋白質(zhì)，可以先將上清液透析，然后過(guò)柱。

　　參考二：

　　蛋白要保持活性，必須維持三維構(gòu)象，而在有機(jī)溶劑處理的情況下，蛋白的三維構(gòu)象被破壞，自然就沒(méi)有活性了。

　　如果你的培養(yǎng)液是高鹽濃度的，你可以在得到上清的可溶性蛋白后，加入5-10倍體積的復(fù)性液，以稀釋鹽濃度，防止在下一步透析過(guò)程中隨著鹽濃度的降低，造成蛋白析出沉淀而喪失活性，然后用透析袋進(jìn)行透析，4度以防止蛋白降解，4-6小時(shí)，然后冷凍干燥，這樣得到的蛋白就能保持活性了。

　　參考三：

　　你的蛋白鏈內(nèi)有二硫鍵么?結(jié)構(gòu)一般不會(huì)太復(fù)雜吧?除非有復(fù)雜的二硫鍵，這么小的蛋白，復(fù)性應(yīng)該不是主要矛盾。

　　一些小蛋白如果在有機(jī)溶劑中發(fā)生的疏水結(jié)構(gòu)的改變是可逆的，而且疏水性較強(qiáng)，那可能就可以用氯仿抽提，很容易和大部分蛋白分開(kāi)，不過(guò)脂類和脂蛋白肯定去不掉。

　　但是能溶于氯仿，你的蛋白我懷疑很有可能一般的水相條件并不是很好溶，先確定一下這個(gè)問(wèn)題，然后結(jié)合你的測(cè)活方法，看看是不是在測(cè)活的時(shí)候蛋白失活的。

　　參考四：

　　我的蛋白確實(shí)是在一般的水相條件不好溶，活性的檢測(cè)方法沒(méi)什么問(wèn)題，

　　氯仿抽提后用6M的尿素溶解，加ddH2O 倍比稀釋后檢測(cè)活性! 這是文獻(xiàn)上的方法，可總是沒(méi)有活性。 不知道是不是氯仿抽提的方法有問(wèn)題? 氯仿抽提法有沒(méi)有什么要注意的地方?

　　參考五：

　　培養(yǎng)上清中沒(méi)有尿素，可能蛋白濃度不高，但還是要確定一下蛋白能溶么?

　　或是直接純化前取上清測(cè)活看看，到底是不是氯仿的問(wèn)題。

　　參考六：

　　我所提的蛋白是不溶于水的，但是在6M、8M的尿素中是可容的

　　取上清做證實(shí)上清是有活性的，所以我覺(jué)得是尿素沒(méi)有將我所需求的蛋白抽提出來(lái)，不知道是不是細(xì)節(jié)上出了些問(wèn)題?各位，有沒(méi)有更好的辦法呢?

　　參考七：

　　是氯仿沒(méi)有把我所需的蛋白抽提出來(lái)