電泳的基本原理

　　電泳是指帶電顆粒在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可電離基團，它們在某個特定的pH值下可以帶正電或負電，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動。電泳技術(shù)就是利用在電場的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而對樣品進行分離、鑒定或提純的技術(shù)。

　　電泳過程必須在一種支持介質(zhì)中進行。Tiselius等在1937年進行的自由界面電泳沒有固定支持介質(zhì)，所以擴散和對流都比較強，影響分離效果。于是出現(xiàn)了固定支持介質(zhì)的電泳，樣品在固定的介質(zhì)中進行電泳過程，減少了擴散和對流等干擾作用。最初的支持介質(zhì)是濾紙和醋酸纖維素膜，目前這些介質(zhì)在實驗室已經(jīng)應(yīng)用得較少。在很長一段時間里，小分子物質(zhì)如氨基酸、多肽、糖等通常用濾紙或纖維素、硅膠薄層平板為介質(zhì)的電泳進行分離、分析，但目前則一般使用更靈敏的技術(shù)如HPLC等來進行分析。這些介質(zhì)適合于分離小分子物質(zhì)，操作簡單、方便。但對于復(fù)雜的生物大分子則分離效果較差。凝膠作為支持介質(zhì)的引入大大促進了電泳技術(shù)的發(fā)展，使電泳技術(shù)成為分析蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝膠是淀粉凝膠，但目前使用得最多的是瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠。蛋白質(zhì)電泳主要使用聚丙烯酰胺凝膠。

　　電泳裝置主要包括兩個部分：電源和電泳槽。電源提供直流電，在電泳槽中產(chǎn)生電場，驅(qū)動帶電分子的遷移。電泳槽可以分為水平式和垂直式兩類。垂直板式電泳是較為常見的一種，常用于聚丙烯酰胺凝膠電泳中蛋白質(zhì)的分離。電泳槽中間是夾在一起的兩塊玻璃板，玻璃板兩邊由塑料條隔開，在玻璃平板中間制備電泳凝膠，凝膠的大小通常是12cm´ 14 cm，厚度為1mm～2 mm，近年來新研制的電泳槽，膠面更小、更薄，以節(jié)省試劑和縮短電泳時間。制膠時在凝膠溶液中放一個塑料梳子，在膠聚合后移去，形成上樣品的凹槽。水平式電泳，凝膠鋪在水平的玻璃或塑料板上，用一薄層濕濾紙連接凝膠和電泳緩沖液，或?qū)⒛�膠直接浸入緩沖液中。由于pH值的改變會引起帶電分子電荷的改變，進而影響其電泳遷移的速度，所以電泳過程應(yīng)在適當?shù)木彌_液中進行的，緩沖液可以保持待分離物的帶電性質(zhì)的穩(wěn)定。

　　E=V/L

　　為了更好的了解帶電分子在電泳過程中是如何被分離的，下面簡單介紹一下電泳的基本原理。在兩個平行電極上加一定的電壓(V)，就會在電極中間產(chǎn)生電場強度(E)，上式中L是電極間距離。

　　在稀溶液中，電場對帶電分子的作用力(F)，等于所帶凈電荷與電場強度的乘積：

　　F=q*E

　　上式中q是帶電分子的凈電荷，E是電場強度。

　　這個作用力使得帶電分子向其電荷相反的電極方向移動。在移動過程中，分子會受到介質(zhì)粘滯力的阻礙。粘滯力(F’)的大小與分子大小、形狀、電泳介質(zhì)孔徑大小以及緩沖液粘度等有關(guān)，并與帶電分子的移動速度成正比，對于球狀分子，F(xiàn)’的大小服從Stokes定律，即：

　　F’=6πrηυ

　　式中r是球狀分子的半徑，η是緩沖液粘度，υ是電泳速度(υ= d / t，單位時間粒子運動的距離，cm / s )。當帶電分子勻速移動時： F = F’，

　　 q·E = 6πrηυ

　　電泳遷移率(m)是指在單位電場強度(1V/cm)時帶電分子的遷移速度：

　　所以：

　　v/E=Q/6πrη

　　這就是遷移率公式，由上式可以看出，遷移率與帶電分子所帶凈電荷成正比，與分子的大小和緩沖液的粘度成反比。

　　用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量時，實際使用的是相對遷移率mR。即：

　　上式中：d-帶電粒子泳動的距離，t-電泳的時間，V-電壓，L-兩電極交界面之間的距離，即凝膠的有效長度。因此，相對遷移率mR就是兩種帶電粒子在凝膠中泳動遷移的距離之比。

　　帶電分子由于各自的電荷和形狀大小不同，因而在電泳過程中具有不同的遷移速度，形成了依次排列的不同區(qū)帶而被分開。即使兩個分子具有相似的電荷，如果它們的分子大小不同，由于它們所受的阻力不同，因此遷移速度也不同，在電泳過程中就可以被分離。有些類型的電泳幾乎完全依賴于分子所帶的電荷不同進行分離，如等電聚焦電泳;而有些類型的電泳則主要依靠分子大小的不同即電泳過程中產(chǎn)生的阻力不同而得到分離，如SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。分離后的樣品通過各種方法的染色，或者如果樣品有放射性標記，則可以通過放射性自顯影等方法進行檢測。