實(shí)時(shí)熒光定量PCR的使用步驟

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的使用步驟：
1.樣品RNA的抽提
①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。
②兩相分離。每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無(wú)色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉淀。將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見(jiàn)的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
④RNA清洗。移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀�；靹蚝�，4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥。小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解RNA沉淀。溶解RNA時(shí)，先加入無(wú)RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。

2.RNA質(zhì)量檢測(cè)
1）紫外吸收法測(cè)定
先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋?zhuān)?/FONT>1：100）后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測(cè)定RNA溶液濃度和純度。
①濃度測(cè)定：A260下讀值為1表示40mg RNA/ml。樣品RNA濃度(g/ml)計(jì)算公式為：A260×稀釋倍數(shù)×40mg/ml。
具體計(jì)算如下：
RNA溶于40ml DEPC水中，取5ul，1：100稀釋至495ml的TE中，測(cè)得A260 = 0.21
RNA濃度= 0.21×100×40mg/ml = 840mg/ml或0.84mg/ml
取5ul用來(lái)測(cè)量以后，剩余樣品RNA為35ml，剩余RNA總量為：
35 ml×0.84 mg/ml=29.4mg
②純度檢測(cè)：RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。
2）變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定
①制膠：1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10×MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3M)。
10×MOPS電泳緩沖液
濃度　　成分
0.4M　　MOPS，pH 7.0
0.1M　　乙酸鈉
0.01M　 EDTA
灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25ml溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。
②準(zhǔn)備RNA樣品：取3mgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10mg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。
③電泳：上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。5-6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2-3cm。
④紫外透射光下觀(guān)察并拍照
28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類(lèi)型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀(guān)察到一個(gè)更小稍微擴(kuò)散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過(guò)程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會(huì)在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果。