細胞免疫形態(tài)學(xué)檢測法

　　一些淋巴細胞，如CTL、NK、LAK等對靶細胞具有直接的殺傷作用，可以根據(jù)待檢測的效應(yīng)細胞的性質(zhì)選用相應(yīng)的靶細胞，如腫瘤細胞、移植供體細胞等，可用于腫瘤免疫、移植排斥反應(yīng)、病毒感染等方面的研究。免疫效應(yīng)細胞毒實驗是在組織培養(yǎng)中研究淋巴細胞、抗體或抗體依賴性淋巴細胞殺傷靶細胞的一種技術(shù)，也是在體外研究特異性細胞免疫比較可靠和靈敏的方法，檢測方法有形態(tài)法、放射性同位素法、乳酸脫氫酶釋放法、MTT法、流式細胞儀法等。

　　形態(tài)學(xué)檢測法（以CTL為例）
　�。�一）原理：形態(tài)學(xué)檢查法是根據(jù)體外貼壁生長的靶細胞被CTL殺傷后失去貼壁的能力，所以從貼壁細胞數(shù)目減少情況可判斷CTL殺靶細胞的能力。形態(tài)學(xué)方法不需要特殊設(shè)備，僅用顯微鏡計數(shù)靶細胞的存活數(shù)，操作方便。

　�。�二）材料
　　1．新鮮的外周（肝素）抗凝血液。
　　2．靶細胞（通常選用傳代的腫瘤細胞如K562）。
　　3．RPMI 1640培養(yǎng)液、PBS緩沖液。
　　4．96孔酶聯(lián)免疫塑料板、微量試驗板。

　�。�三）方法
　　1．靶細胞的接種用RPMI 1640培養(yǎng)液將腫瘤細胞培養(yǎng)物制成懸液，并稀釋1×103／ml的細胞濃度。于微量試驗板的小孔內(nèi)分別接種0.1 ml腫瘤細胞（內(nèi)含1。。個細胞），5％CO 237℃孵箱培育24h。細胞貼壁后，輕輕棄去培養(yǎng)基，加1ml PBS洗滌，輕去洗滌液及未貼壁細胞。
　　2．淋巴細胞分離液制備PBMC
　�。�1）將4ml分層液置試管下層，然后將抗凝血（1ml靜脈血與1ml肝素混勻，再用Hank’s液對倍稀釋）輕輕鋪于分層液上，使分層良好。
　�。�2）用水平離心機2000r／min離心20min，用毛細吸管將單個核細胞吸出，并用Hank’s液洗滌3次，每次1500r／min離心10min，取懸液0．1ml加等量血細胞稀釋液，計數(shù)，最后配成（2～4）×105／ml的細胞懸液。
　　3．細胞毒性反應(yīng)
　　（1）淋巴細胞與腫瘤細胞反應(yīng)：向小孔分別加入0.2ml不同濃度的淋巴細胞（分別含有5×105，5×104，5×lO3），使淋巴細胞與癌細胞之比依次為1000：1、l00：1、lO：1。
　�。�2）每小孔補加含20％NCS的RPMI 1640培養(yǎng)液O．1ml，5%CO2 37℃孵箱培育2～3d。
　�。�3）2％臺盼藍染色，翻轉(zhuǎn)微量試驗板，計數(shù)活存的腫瘤細胞，并設(shè)正常人淋巴細胞代替腫瘤患者淋巴細胞作對照，每份需同時做3個復(fù)孔，分別檢查各孔中存活細胞數(shù)，計算各孔平均殘留細胞數(shù)，便可求出淋巴細胞對腫瘤細胞生長的抑制率（即細胞毒性）。

　�。�四）結(jié)果分析：鏡檢計數(shù)每孔底殘留的細胞數(shù)，以抑制率表示。